Lipidenresolutie in levende cellen: een nieuwe doorbraak in hyperspectrale midden-infrarood foto-akoestische microscopie

Lipiden zijn niet alleen structurele componenten van celmembranen en energieopslagmoleculen, maar ze zijn ook nauw verbonden met het optreden en de ontwikkeling van kanker, obesitas, diabetes, hart- en vaatziekten en neurodegeneratieve ziekten. Het direct observeren en onderscheiden van verschillende soorten lipiden in levende cellen staat echter al lang voor technische uitdagingen. Traditionele fluorescerende labelingsmethoden worden beperkt door de efficiëntie, specificiteit en mogelijke interferentie met cellulaire functies, terwijl labelvrije optische technieken vaak moeite hebben om lipidemoleculen met vergelijkbare chemische structuren te onderscheiden.

Nature Methods heeft een studie gepubliceerd waarin een technologie wordt geïntroduceerd genaamd "Hyperspectral Fingerprint-region Photoacoustic Microscopy" (hyFOPM). Door gebruik te maken van de single-bond vibratiemodi in het midden-infrarode vingerafdrukgebied, maakt deze technologie labelvrije detectie en dynamische beeldvorming van sfingomyeline (SM) en cholesterol (Chol) in levende cellen mogelijk.

Technische principes
De meeste labelvrije optische methoden zijn afhankelijk van signalen in het CH-uitrekkende trillingsgebied (ongeveer 2800–3000 cm⁻¹), maar de spectrale banden in dit gebied zijn zeer vergelijkbaar voor verschillende lipiden, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen verschillende typen. Het midden-infrarode vingerafdrukgebied (900–1730 cm⁻¹) bevat daarentegen meer trillingsinformatie over enkele bindingen die de unieke structuur van moleculen weerspiegelt, zoals de karakteristieke absorptie van amidebindingen, esterbindingen en steroïderingen.

Het ontwerp van het hyFOPM-systeem concentreert zich op dit concept. Het maakt gebruik van een afstembare kwantumcascadelaser als excitatiebron, die het bereik van 900–2932 cm⁻¹ bestrijkt met een spectrale resolutie van 2 cm⁻¹. Laserpulsen prikkelen het monster om foto-akoestische signalen te genereren, die worden gedetecteerd door een ultrasone transducer om hyperspectrale beelden te construeren. Het systeem heeft een ruimtelijke resolutie van ongeveer 4,3 μm, waardoor beeldvorming op het niveau van levende cellen mogelijk is.

Validatie van lipidenmodellen
Om de haalbaarheid van de technologie te verifiëren, heeft het onderzoeksteam eerst tweedimensionale lipidenoplossingmodellen opgesteld die cholesterol (Chol), onverzadigde fosfatidylcholine (DOPC) en sfingomyeline (SM) bevatten.

(1) Vergelijking van spectrale kenmerken

De spectra van het vingerafdrukgebied verzameld door hyFOPM zijn zeer consistent met ATR-FTIR-resultaten. De drie lipiden vertonen onderscheidbare spectrale pieken: cholesterol vertoont een sterke absorptiepiek voor vervorming van de steroïdering bij 1056 cm⁻¹; DOPC beschikt over C=O-strekvibratie van de estergroep bij 1731 cm⁻¹; en sfingomyeline komt overeen met de amide I-band, amide II-band en vetzuur CH2-buigvibratie bij respectievelijk 1645 cm⁻¹, 1555 cm⁻¹ en 1464 cm⁻¹.

(2) Spectrale ontmengings- en classificatiemogelijkheden
Wanneer slechts 15 golfgetallen in het vingerafdrukgebied worden gebruikt voor lineaire ontmenging, is de overspraak tussen cholesterol en sfingomyeline bijna 0%, terwijl de overspraak voor DOPC 23% is. Daarentegen neemt de overspraak aanzienlijk toe bij gebruik van 7 golfgetallen in het CH-uitrekgebied. Verdere toepassing van lineaire discriminantanalyse (LDA) laat zien dat de gemiddelde classificatienauwkeurigheid 96% bereikt bij gebruik van het vingerafdrukgebied of het CH-gebied, en 97% bereikt bij gebruik van alle golfgetallen.

(3) Modellen voor gigantische unilamellaire blaasjes (GUV).
De studie bereidde drie soorten GUV's voor om celmembranen te simuleren: Model 1, een 1:1 mengsel van SM en Chol, dat een dicht geordend membraan vormt; Model 2, een 2:2:1-mengsel van DOPC, SM en Chol, dat naast elkaar bestaat in vloeistofgeordende en vloeistofgeordende fasen; en Model 3, pure DOPC, die een ongeordend vloeistofmembraan vormt. De beelden verkregen door hyFOPM bij 2852 cm⁻¹ zijn morfologisch consistent met die verkregen door fluorescerende Nile Red-kleuring. De spectrale kenmerken van verschillende blaasjes komen overeen met zuivere lipiden, wat bevestigt dat individuele componenten in gemengde membranen kunnen worden geïdentificeerd.

(4) Kwaliteitscontroletoepassingen
Door spectrale metingen uit te voeren op 10 verschillende GUV's voor elk type en ternaire fasediagrammen uit te zetten, ontdekte het onderzoeksteam dat de werkelijke lipidensamenstelling afweek van de doelverhouding (een discrepantie van ongeveer 40%). Dit geeft aan dat hyFOPM kan worden gebruikt voor kwaliteitsbeoordeling bij GUV-voorbereiding.

Toepassingen in levende cellen
De studie paste hyFOPM verder toe op levende cellen, waarbij de dynamische veranderingen van respectievelijk sfingomyeline en cholesterol in twee celmodellen werden waargenomen.

(1) Accumulatie van sfingomyeline in A549-cellen
Menselijke longadenocarcinoomcellen (A549) werden behandeld met de antitumorverbinding 2-hydroxyoliezuur (2-OHOA), waarvan wordt verwacht dat deze de accumulatie van sfingomyeline induceert. Spectra van het vingerafdrukgebied (1600–1400 cm⁻¹) werden verzameld uit 50 cellen, wat aantoont dat het piekoppervlak van 1464 cm⁻¹ na behandeling met 117% toenam, vergeleken met slechts 23% in de controlegroep in dezelfde periode. Vervolgens werd beeldvorming uitgevoerd op 3000 cellen met behulp van slechts vier golfgetallen (2852 cm⁻¹ voor totale lipiden, 1540 cm⁻¹ voor proteïne-amide II, 1464 cm⁻¹ voor sfingomyeline en 1048 cm⁻¹ voor cholesterol). De resultaten toonden aan dat het sfingomyelinesignaal 48 en 72 uur na de behandeling bleef stijgen, terwijl het cholesterolsignaal geen significante verandering vertoonde.

(2) Cholesterollading in HEK-cellen
Menselijke embryonale niercellen (HEK293) werden samen geïncubeerd met een methyl-β-cyclodextrine-cholesterolcomplex (MβCD-Chol) om het cholesterol in het celmembraan te verhogen. Spectra van het vingerafdrukgebied van 50 cellen lieten zien dat het piekoppervlak van 1048 cm⁻¹ na behandeling met 161% toenam, terwijl de piek van 1464 cm⁻¹ voor sfingomyeline licht afnam – consistent met de bekende eigenschap dat cyclodextrine sommige membraanlipiden extraheert terwijl het cholesterol afgeeft. Beeldvorming met meerdere golven van 3000 cellen bevestigde verder de verhoging van het cholesterolsignaal, met een lichte toename van het totale lipidensignaal en weinig verandering in het eiwitsignaal.

Betekenis en vooruitzichten
Deze studie toont het vermogen aan om lipidemoleculen met vergelijkbare chemische structuren in levende cellen te onderscheiden zonder labeling. Vergeleken met traditionele methoden die afhankelijk zijn van fluorescerende of isotopische labeling, vermijdt hyFOPM problemen zoals labelingsefficiëntie en interferentie met cellulaire functies, en de selectiviteit ervan kan flexibel worden aangepast aan de spectrale kenmerken van doellipiden door de excitatiegolfgetallen aan te passen.

De spectrale specificiteit van het huidige systeem in het vingerafdrukgebied is superieur aan die van het CH-uitrekgebied, wat mogelijkheden opent voor het onderscheiden van meer lipidesubtypen. De studie wijst er ook op dat het combineren van geavanceerde spectrale ontmengingstechnieken, zoals deep learning, naar verwachting de gevoeligheid en specificiteit verder zal verbeteren. Bovendien kan midden-infrarood foto-akoestische microscopie een beelddiepte van meer dan 150 μm in weefsel bereiken, en toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar dikke monsters of in vivo-instellingen. Technologische versnelling (bijvoorbeeld spectrale onderbemonstering) en systeemminiaturisatie zijn belangrijke richtingen voor het bevorderen van deze technologie in de richting van point-of-care-analyse of routinematige laboratoriumtests.